Se requiere un sistema de inyección contráctil para la muerte celular regulada por el desarrollo en Streptomyces coelicolor

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1469 (2023) Citar este artículo

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Diversas especies bacterianas producen sistemas de inyección contráctil extracelular (eCIS). Aunque están estrechamente relacionados con las colas de fagos contráctiles, los eCIS pueden inyectar proteínas tóxicas en células eucariotas. Por tanto, estos sistemas se consideran comúnmente mecanismos de defensa citotóxicos que no son fundamentales para otros aspectos de la biología bacteriana. Aquí, proporcionamos evidencia de que los eCIS parecen participar en el complejo proceso de desarrollo de la bacteria Streptomyces coelicolor. En particular, mostramos que S. coelicolor produce partículas eCIS durante su ciclo de crecimiento normal, y que las cepas que carecen de partículas eCIS funcionales exhiben alteraciones pronunciadas en su programa de desarrollo. Además, los mutantes deficientes en eCIS muestran niveles reducidos de muerte celular y morfología alterada durante el crecimiento en medios líquidos. Nuestros resultados sugieren que la función principal de los eCIS en S. coelicolor es modular el cambio de desarrollo que conduce a la formación de hifas aéreas y la esporulación, en lugar de atacar a otras especies.

Muchas cepas de bacterias codifican sistemas de inyección contráctil extracelular (eCIS)1,2,3. Los eCIS están estrechamente relacionados con las colas de bacteriófagos (fagos) de cola contráctil. Al igual que las colas, están compuestas por un tubo largo unido a una placa base (Fig. 1a). Las proteínas que comprenden la estructura en forma de cola de eCIS son similares en secuencia a las proteínas de los fagos. Sin embargo, las regiones genómicas que codifican eCIS se distinguen de las regiones de la cola del fago porque invariablemente codifican una ATPasa AAA+ de función desconocida y una proteína terminadora de la cola (TR) que es miembro de la familia Pfam Pvc16_N (PF14065)4,5. También suelen codificar proteínas toxinas reconocibles2,6,7. Todos los eCIS con funciones caracterizadas median en las interacciones entre células bacterianas y eucariotas. Las especies de Serratia y Photorhabdus liberan estructuras eCIS, conocidas como profagos antialimentación (Afp) y casetes de virulencia Photorhabdus (PVC), respectivamente, que median en la destrucción de células de insectos8,9. Esta muerte se produce mediante la inyección de toxinas insecticidas codificadas aguas abajo del operón eCIS8,9,10. Las MAC (estructuras contráctiles asociadas a la metamorfosis) son eCIS distintas producidas por la bacteria marina Pseudoalteromonas luteoviolacea, que son necesarias para la morfogénesis del gusano tubícola Hydroides elegans en una interacción mutualista11. Se han examinado en detalle las estructuras de varios otros eCIS12,13,14, pero no se han determinado sus funciones.

una ilustración esquemática de una partícula eCIS. El diagrama muestra los componentes estructurales centrales conservados de la cola de un eCIS. Las proteínas se indican mediante abreviaturas (TR = terminador de la cola; TT = tubo de la cola; TS = vaina de la cola; BH1, BH2 = componentes del cubo de la placa base; BW1, BW2, BW3 = componentes de la cuña de la placa base; BS = punta de la cola). b, Representación esquemática del grupo eCIS de Streptomyces coelicolor (Sco). Los marcos de lectura abiertos y su dirección transcripcional se representan mediante flechas de bloque y se dibujan a escala. El nombre del gen se muestra debajo del primer y último gen del grupo, que abarca desde sco4242-sco4263. La función eCIS codificada se muestra como una abreviatura encima de cada ORF. La anotación Afp eCIS, que se utiliza en algunas otras publicaciones, se muestra dentro de las flechas (Afp1-1619). Las dos regiones promotoras divergentes se muestran como bloques rojos. Las direcciones transcripcionales directas e inversas se muestran en flechas azules sobre el grupo. c, los eCIS se purificaron a partir de lisados de Sco cultivados en medio líquido YEME durante 72 horas como se describe en Métodos. Las preparaciones purificadas se concentraron a 30 veces la concentración del cultivo original. Las imágenes de electrones de transmisión se recogieron con un aumento de 100.000X. Las puntas de flecha blancas apuntan a fundas vacías, presentes junto con el eCIS completamente ensamblado. d Se muestra una única partícula eCIS ensamblada en su conformación extendida no contraída. La flecha blanca apunta a la placa base y la flecha negra muestra el complejo terminador de cola. e Las partículas de los medios libres de células de los cultivos cultivados como se describe en el panel (c) se ultracentrifugaron y concentraron a 30 veces la concentración de la muestra original. Imágenes recopiladas con un aumento de 80.000X. Las flechas blancas apuntan a las típicas partículas de la vaina de la cola contraídas y vacías. Barra de escala = 100 nm. f Gráfico de dispersión de la longitud y el ancho de las partículas derivadas de eCIS descritas en (c – e) (n = 80 para partículas intracelulares no contraídas completamente ensambladas, n = 215 para partículas de vaina vacías contraídas extracelulares). Dentro de cada gráfico, las líneas horizontales indican los valores medios, que también se muestran encima del gráfico. Los bordes verticales denotan el rango completo de distribución de valores.

Las regiones eCIS se han diseminado claramente mediante transferencia horizontal de genes y esto ha resultado en su aparición esporádica en diversos clados bacterianos2,3. Una sorprendente excepción a este patrón se observa en el género Streptomyces, donde la mayoría de las especies (>70%) codifican al menos un eCIS. Streptomyces se propaga a través de un complejo programa de desarrollo. Las esporas germinadas inicialmente crecen para formar extensas hifas vegetativas mediante una combinación de extensión y ramificación de la punta15. Tras la privación de nutrientes o el estrés, los cambios morfológicos y de desarrollo programados dan como resultado la formación de hifas aéreas y la posterior formación de esporas. Este cambio en el desarrollo va acompañado de un gran cambio en la expresión genética y el inicio de la producción de metabolitos secundarios, muchos de los cuales son antibióticos16,17.

Dado el estilo de vida excepcionalmente complejo de Streptomyces y la prevalencia de regiones codificantes de eCIS en este género, planteamos la hipótesis de que eCIS puede desempeñar un papel fundamental en el programa de desarrollo de estas bacterias. Para probar esta idea, iniciamos estudios sobre la región codificante de eCIS de la cepa modelo Streptomyces coelicolor A3(2) (Sco), que tiene una única región codificante de eCIS. Los objetivos de estos experimentos eran determinar si los eCIS se producen como parte del ciclo de vida normal de Sco y qué papel podrían estar desempeñando estas entidades poco caracterizadas.

Las partículas eCIS se construyen a partir de un conjunto conservado de proteínas estructurales que son homólogas a las proteínas que se encuentran en los fagos de cola contráctil (Fig. 1a)18. La porción tubular comprende un tubo de cola (TT) recubierto por una funda (TS) que media la contracción. El tubo está unido por un extremo a una placa base construida uniendo seis cuñas (compuestas por proteínas BW1, BW2 y BW3) a un centro que contiene las proteínas BH1 y BH2. El otro extremo del tubo está tapado por la proteína terminadora (TR). La unión a la superficie celular suele estar mediada por fibras adheridas a la placa base. Los genes que codifican todas las proteínas estructurales eCIS conservadas y una ATPasa AAA +, que también se conserva en regiones codificantes de eCIS, se encuentran en una región del genoma Sco (Fig. 1b).

Para determinar si Sco de tipo salvaje (WT) produce partículas de eCIS, los lisados celulares de cultivos de Sco cultivados en medio líquido durante 72 horas se sometieron a un protocolo de purificación de eCIS estándar (ver Métodos). El examen de las muestras purificadas resultantes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló abundantes partículas similares a colas de fagos con longitudes promedio de 295 nm y anchos de 21 nm (Fig. 1c, d, f). Estas partículas se parecen mucho a las partículas eCIS observadas anteriormente con una tapa redondeada en un extremo y una placa base en el otro, como lo indican las flechas (Fig. 1d)5,19,20. La placa base es algo más pequeña que la de otros eCIS y las fibras que están unidas a las placas base de algunos eCIS5,11,21 no fueron detectables. Las muestras purificadas también contenían muchas estructuras de vaina vacías de longitud variable (Fig. 1c, puntas de flecha blancas).

Sorprendentemente, las micrografías TEM de la fracción extracelular (sobrenadante recolectado después de la sedimentación celular) revelaron solo lo que parecían ser vainas vacías que quedaron después de la contracción de eCIS (Fig. 1e). Estas estructuras tenían entre 100 y 150 nm de largo y entre 28 y 35 nm de ancho con un patrón de estriación típico característico de la vaina de la cola polimerizada, pero no tenían densidad en el centro y eran más anchas que las colas eCIS maduras de tipo salvaje (Fig. 1f). La proteína de la vaina de la cola (TS) también se detectó en la fracción extracelular (E) mediante transferencia Western (Figuras complementarias 1a, b, d). La proteína estrictamente citoplasmática, ActR, no se detectó en la fracción extracelular (Figuras complementarias 1b, d), lo que sugiere que la aparición de la proteína TS en esta fracción no se debió a una lisis celular generalizada. Las cepas Sco que tienen deleciones en los genes que codifican la vaina de la cola (ΔTS) o las proteínas de la cuña de la placa base (ΔBP) no mostraron estructuras similares a la cola en muestras extracelulares o lisados celulares. Las transferencias Western confirmaron la ausencia de estas proteínas en las preparaciones de cepas mutantes (Figuras complementarias 1a, c, d).

Para investigar el papel de la ATPasa en la formación de partículas eCIS, generamos una eliminación en el gen Sco AAA + ATPasa (sco4259) y realizamos experimentos TEM como se describe anteriormente en lisados de este mutante. Las partículas de eCIS producidas parecían idénticas a las producidas por la cepa WT (Figura complementaria 2a). También se observaron niveles similares de vainas vacías extracelulares (Figuras complementarias 2b, c). Estos resultados implican que la ATPasa no es necesaria para la producción de partículas similares a eCIS con apariencia normal y capacidad de contraerse. Este hallazgo concuerda con el trabajo sobre Photorhabdus eCIS5, que también demostró que las partículas eCIS de aspecto normal se forman en ausencia de ATPasa5.

Utilizamos espectrometría de masas para determinar la composición de las partículas purificadas en forma de cola producidas por Sco. Como se esperaba, la mayoría de las proteínas estructurales eCIS (Fig. 1a) que tienen homólogos de cola de fago se detectaron en las tres purificaciones (TR, TS, TT, BH2, BW2), mientras que se detectaron otras de estas proteínas estructurales conservadas (BH1 y BW1). en al menos una de las tres purificaciones separadas realizadas (Tablas complementarias 1 y 2). BW3 fue la única proteína estructural conservada que no se detectó en ninguna purificación. En las tres purificaciones se detectaron dos proteínas de función desconocida, codificadas por los genes sco4242 y sco4256, y otra, codificada por sco4251, en al menos una purificación. No se detectó AAA+ ATPasa en partículas de eCIS purificadas. También realizamos espectrometría de masas en partículas relacionadas con eCIS purificadas de la fracción extracelular. En este caso detectamos sólo las proteínas TS y TT, que son los componentes probables de las vainas contraídas vacías observadas por TEM. Es importante destacar que las preparaciones purificadas producidas a partir del mutante ∆BP contenían solo proteínas TT y TS, lo que demuestra que la detección de la mayoría de las proteínas eCIS requiere el ensamblaje adecuado de eCIS, lo que no puede ocurrir en ausencia de las proteínas de cuña de la placa base5. Los agregados de proteína TS y TT aún pueden purificarse mediante centrifugación de alta velocidad. En general, estos experimentos de espectrometría de masas muestran que las partículas en forma de cola que hemos purificado se producen en la región eCIS de Sco y que la composición de estas partículas es la misma que la de otros eCIS.

Un estudio previo implicaba al eCIS de Streptomyces lividans como responsable de una actividad inhibidora del crecimiento contra la levadura Saccharomyces cerevisiae22. Dado que los componentes del eCIS de S. lividans son muy similares en secuencia a los del sistema Sco, era interesante determinar si el Sco eCIS también mostraba esta actividad. Como se muestra en la Fig. 2a, encontramos que WT Sco efectivamente inhibió el crecimiento de S. cerevisiae y que esta actividad no se observó para la cepa ∆TS. Como se sabe que Sco produce varios antibióticos que podrían contribuir a la inhibición del crecimiento observada, probamos la capacidad de la cepa Sco M115223, en la que se eliminan las regiones genómicas necesarias para la síntesis de los cuatro principales antibióticos Sco (Δact, Δred, Δcda, Δcpk). , para inhibir el crecimiento de la levadura. Confirmamos que esta cepa todavía produce partículas relacionadas con eCIS (Figura complementaria 3a). Descubrimos que ni la cepa M1152 ni una versión mutante de esta cepa que no produce eCIS (M1152∆TS) inhibieron el crecimiento de la levadura (Fig. 2a). Estos resultados implican que se requieren antibióticos para la inhibición del crecimiento de S. cerevisiae y que la ausencia de eCIS puede afectar indirectamente la actividad inhibidora al perturbar la producción de antibióticos.

Los ensayos se realizaron manchando en placas de agar 105 SFU de Sco de tipo salvaje (WT), knockout de la vaina de la cola (ΔTS), M1152 (un mutante que no produce los cuatro principales antibióticos Sco), o M1152 que alberga una mutación knockout de la vaina de la cola ( M1152 ΔTS). Las células se cultivaron durante 3 días antes de superponerse con las especies que se iban a probar como se indica en cada panel. a Las zonas de claro alrededor de las colonias de Sco indican letalidad o actividad inhibidora del crecimiento contra el césped indicador. Todos los resultados mostrados para una cepa analizada se obtuvieron de la misma placa de agar. b La actividad inhibidora de las cepas Sco M145 se cuantificó calculando el área de superficie de la zona de aclaramiento alrededor de cada colonia. Los resultados se muestran como diagramas de caja. La línea horizontal central denota la mediana y los cuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 de los valores, los bigotes muestran el rango completo de distribución de valores por cepa. n = 6 experimentos biológicamente independientes en ensayos contra M. luteus, n = 8 en ensayos contra S. cerevisiae (105) y n = 6 en ensayos contra S. cerevisiae (106). Las cepas M1152 no mostraron ninguna actividad inhibidora contra M. luteus o S. cerevisiae. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

De manera similar a nuestros resultados con S. cerevisiae, encontramos que Sco inhibió el crecimiento de la especie bacteriana Gram-positiva Micrococcus luteus, y que esta inhibición se atenuó parcialmente en la cepa ∆TS (Fig. 2a, b). Sin embargo, la cepa M1152 y el mutante ∆TS carecían de esta actividad. Finalmente, encontramos que Sco inhibió el crecimiento de cuatro especies diferentes de Streptomyces, pero la cepa ∆TS mostró el mismo nivel de inhibición, lo que implica que el eCIS no era necesario para la inhibición del crecimiento (Figura complementaria 3b). En resumen, estos experimentos de inhibición del crecimiento demuestran que Sco inhibe el crecimiento de algunas especies bacterianas y S. cerevisiae, pero no parece haber un papel directo para el eCIS en esta actividad.

Dada la aparente falta de destrucción de otras especies por parte del Sco eCIS, postulamos que eCIS podría mediar una actividad de destrucción de células dentro de la cepa durante el programa de desarrollo normal. Para visualizar y cuantificar los niveles de muerte celular durante la diferenciación de Sco, utilizamos un ensayo de viabilidad bacteriana bien establecido24. Las muestras se tiñen con SYTO 9, que marca células vivas y muertas, y con yoduro de propidio (PI), que penetra y tiñe sólo las bacterias con membranas dañadas, que probablemente estén muertas. En presencia de ambas manchas, las bacterias vivas aparecen de color verde, mientras que las bacterias muertas aparecen de color rojo. Después de 48 horas de crecimiento en medio líquido, WT Sco cultivó gránulos de micelio como se había observado anteriormente25,26. El diámetro promedio de estos gránulos fue de 85 µm (Fig. 3a). Se observaron gránulos del mismo tamaño en las cepas deficientes en eCIS. Al cuantificar la tinción con SYTO9 y PI, calculamos que la proporción de células vivas y muertas en los cultivos WT fue de 0,8 (Fig. 3a). Las proporciones vivos/muertos fueron ligeramente menores en los cultivos mutantes, aunque la diferencia no fue significativa. Las diferencias entre las cepas WT y las deficientes en eCIS se hicieron evidentes en los puntos de crecimiento de 54 y 74 horas. Las muestras WT desarrollaron muchos gránulos de micelio grandes con un diámetro de 100 a 300 µm que mostraron una mayor tinción de PI en el centro (Fig. 3b, c). Por el contrario, en ambos mutantes deficientes en eCIS, la preponderancia de los gránulos de hifas observados se mantuvo pequeña y el tamaño promedio de los gránulos fue la mitad que el de WT Sco. Además, las proporciones de células vivas/muertas de los mutantes fueron el doble que las de WT (Fig. 3b, c). En general, estos datos muestran que el desarrollo de WT Sco en medios líquidos va acompañado de la formación de grandes gránulos de micelio y niveles considerables de muerte celular. Los mutantes que carecen de partículas eCIS se desvían significativamente de este comportamiento y muestran gránulos celulares más pequeños y una frecuencia mucho menor de muerte celular.

Se inocularon cepas Sco de tipo salvaje (WT), knockout de la vaina de la cola (ΔTS) o knockout de la placa base (ΔBP) en 50 ml de medio YEME a una concentración final de 107 SFU/ml. A, 48 h, b, 54 h o c, 74 h después de la inoculación, las muestras se tiñeron con proporciones iguales de SYTO 9, una tinción de ácido nucleico permeable a la membrana, y yoduro de propidio, que tiñe solo células muertas o dañadas. Por lo tanto, las células muertas y vivas se visualizan mediante fluorescencia roja y verde, respectivamente. La proporción de células vivas/muertas se calculó a partir de los valores de intensidad de fluorescencia total por imagen. Los diámetros de los gránulos de micelio individuales se midieron manualmente (para WT, ΔTS y ΔBP, respectivamente; a las 48 h – n = 99, 116, 131, a las 54 h – n = 173, 113, 138 y a las 74 h – n = 73, 69, 71). Los resultados se muestran como diagramas de caja. La línea horizontal central denota la mediana y los cuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 de los valores. Los bigotes denotan valores dentro del rango del percentil 5 al 95, y se muestran puntos de datos individuales para los valores fuera de ese rango. Se realizaron ANOVA unidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett para calcular la significación estadística. Los valores P ajustados se muestran encima de los gráficos relevantes. En (b), valor de P para proporciones vivos/muertos = 2,96E-06 (WT frente a ΔTS), 1,33E-13 (WT frente a ΔBP), valor de P para tamaño de pellet = 2,9E-31 (WT frente a ΔTS ), 1.1E-26 (WT frente a ΔBP). En (c), valor de P para proporciones vivos/muertos = 8,2E-05 (WT frente a ΔTS), 9,5E-08 (WT frente a ΔBP), valor de P para tamaño de pellet = 4,9E-20 (WT frente a ΔTS ), 4.2E-17 (WT frente a ΔBP). Las imágenes mostradas para cada panel son representativas de al menos tres experimentos independientes. Barra de escala = 100 µm. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Para abordar el papel de la proteína AAA + ATPasa en la función eCIS, realizamos el mismo experimento descrito anteriormente utilizando la cepa mutante ∆ATPasa Sco. Aunque esta cepa produce partículas de eCIS con una apariencia normal, los gránulos de micelio producidos por esta cepa después de 54 h de crecimiento en medios líquidos se parecían a los producidos por las cepas mutantes deficientes en eCIS. Estos gránulos tenían aproximadamente la mitad del tamaño de los gránulos WT y mostraban la mitad de la frecuencia de muerte celular (Figura complementaria 4b). Esta tendencia continuó en el momento de las 74 h (Figura complementaria 4c). Al igual que con los otros mutantes deficientes en eCIS, los gránulos de micelio de la cepa ∆ATPasa se parecían a WT después de 48 h de crecimiento (Figura complementaria 4a). Estos datos demuestran que la presencia de partículas en forma de cola por sí sola no media en la muerte celular y que la ATPasa realiza una función necesaria para la actividad biológica de las partículas eCIS.

Sco sigue un programa de desarrollo caracterizado por un cambio de la formación de hifas vegetativas a hifas aéreas, seguidas por la formación de esporas. Para determinar si la falta de eCIS podría perturbar este programa, comparamos el crecimiento de las cepas WT y ∆TS en medios sólidos. En las primeras etapas de crecimiento, el examen visual de las placas de agar no reveló diferencias significativas, y todas las cepas produjeron céspedes vegetativos similares. Sin embargo, después de 48 h, los mutantes eCIS se habían desarrollado visiblemente más rápido en términos de producir el metabolito secundario pigmentado, actinorhodina (Fig. 4a, panel superior). En momentos posteriores, cualquier diferencia aparente visible desapareció y, a las 72 h, todas las cepas habían desarrollado céspedes comparables de micelio aéreo (Fig. 4a, panel inferior). En medios líquidos, observamos que las cepas deficientes en WT y eCIS exhibieron tasas de crecimiento similares (Figura complementaria 5).

Se sembraron en agar R2YE una 108 SFU de Sco de tipo salvaje (WT), dos cepas knockout de la vaina de la cola aisladas independientemente (ΔTS_1 y ΔTS_2) o una cepa knockout de la placa base (ΔBP). El panel superior muestra imágenes representativas del desarrollo de metabolitos secundarios en césped cultivado durante 48 h; El panel inferior muestra el desarrollo de hifas aéreas en las mismas placas que arriba, a las 72 h. b Micrografías de luz de transmisión representativas de impresiones superficiales en cubreobjetos de céspedes de cepas mutantes WT Sco, ΔTS o ΔBP cultivados en agar 42 y 55 h después de la germinación. Las hifas aéreas y las esporas se adhieren al cubreobjetos, pero no las hifas vegetativas. Se muestran dos campos para cada muestra. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con dos réplicas biológicas por cepa. Barra de escala = 20 µm. c La densidad de hifas aéreas de las impresiones superficiales en los cubreobjetos descritas en (b) se cuantificó mediante análisis de imágenes de micrografías ópticas (n = 6 muestras medidas para cada cepa, en cada momento). Los gráficos muestran el valor medio con barras de error que representan la desviación estándar de la media. Los valores de densidad media de los mutantes eCIS se compararon con WT utilizando una prueba t de dos muestras; se muestran los valores de P bilaterales; * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Valores de P = 0,0009, 0,0003 y 0,0024 para muestras de hifas de 42 h ΔTS_1, ΔTS_2 y ΔBP, respectivamente. Valores de P = 0,0012, 0,0003 y 0,0148 para muestras de hifas de 55 h ΔTS_1, ΔTS_2 y ΔBP, respectivamente.

Cabe señalar que la producción de actinorhodina por cepas deficientes en eCIS fue variable según el medio utilizado. En algunas condiciones de crecimiento en medios líquidos o sólidos, estos mutantes produjeron considerablemente menos pigmento que WT (Figuras complementarias 6a-c). Dado que la regulación de la producción de actinorrodina es complicada27,28,29,30,31, es difícil racionalizar estos efectos variables. Sin embargo, la perturbación de la producción de metabolitos secundarios en ausencia de eCIS es consistente con su papel en el programa de desarrollo.

Utilizamos un enfoque de microscopía para obtener una evaluación más clara de la formación de hifas aéreas en momentos intermedios del programa de desarrollo. Aplicamos cubreobjetos de vidrio a la superficie del césped bacteriano en crecimiento. Dado que la superficie de los cubreobjetos es hidrófoba, sólo se adhieren a ellos las hifas aéreas, que tienen una capa hidrófoba. Luego se detectaron hifas adheridas mediante examen microscópico. No se observaron células en cubreobjetos que se habían aplicado a la superficie del césped en ninguna de las muestras hasta 35 horas después de la germinación. A las 42 h, las cepas WT aún no habían producido hifas aéreas visibles, mientras que las cepas mutantes ∆TS y ∆BP mostraron hebras de hifas aéreas bien desarrolladas agrupadas en numerosas regiones en el portaobjetos del microscopio (Fig. 4b, c). Esta tendencia continuó a las 55 horas de crecimiento, donde las cepas WT habían desarrollado algunas hebras de hifas dispersas en comparación con los mutantes deficientes en eCIS, que mostraban grupos de hifas más grandes y desarrollados (Fig. 4b, c).

Dado que la ausencia de eCIS parecía perturbar el programa de desarrollo de Sco, nos preguntamos si los genes que codifican eCIS se expresaban en un patrón regulado por el desarrollo. Con este fin, fusionamos cuatro promotores conocidos de la región eCIS (Fig. 1b; Fig. complementaria 7) con genes transmitidos por plásmidos que codifican la actividad luciferasa (luxCDABE) 32. La introducción de estos plásmidos en WT Sco reveló que los cuatro promotores eCIS estaban activos y mostraban el mismo patrón temporal de expresión (Fig. 5). Este patrón era similar al promotor del gen principal del factor sigma hrdB33, que actúa durante el crecimiento vegetativo y al promotor de redD. Este gen codifica el regulador transcripcional del grupo biosintético rojo, que se transcribe en las primeras etapas del cambio del desarrollo34,35. Estos resultados muestran que los operones eCIS se expresan durante la fase de crecimiento vegetativo en condiciones normales de crecimiento, justo antes del cambio de desarrollo que conduce a la formación de hifas aéreas y la esporulación.

Se conjugó una construcción de fusión de cada promotor eCIS (eCISp1-p4, correspondiente a los promotores P1-P4 que se muestran en la Fig. 1b) con luxCDABE con Sco y se cultivó en placas de agar MS de 96 pocillos durante 7 días. Se utilizaron como controles las cepas informadoras hrdBp y redDp. La luminiscencia se midió tres veces al día. La actividad de los promotores más débiles: eCISp1, eCISp2 y eCISp3 se muestra en vista ampliada en el inserto superior derecho. Se probaron tres réplicas biológicas para cada ensayo (n = 3). La media normalizada al vector vacío se muestra con barras de error que representan la desviación estándar de la media. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Nuestro patrón transcripcional observado para los promotores eCIS es consistente con observaciones previas de que la expresión de eCIS está regulada por bldA36,37,38. Este gen es necesario para el adecuado desarrollo morfológico, metabolismo secundario y esporulación39,40,41. Codifica el único ARNt para el raro codón de leucina, TTA, presente en el 2-3% de los genes de Streptomyces. La producción del supuesto regulador transcripcional eCIS codificado por sco4263 depende de BldA ya que contiene un codón TTA. Analizamos 56 regiones eCIS de Streptomyces y encontramos que 42 contenían al menos un gen que contenía un codón TTA en marco. De los genes identificados que contienen TTA, 22 son supuestos genes reguladores de eCIS (Datos complementarios 1 y 2). Estos hallazgos indican que las regiones eCIS a menudo están reguladas por bldA, lo que garantiza que las partículas eCIS se acumularán junto con la transición morfogenética.

Para abordar la cuestión de si eCIS puede realizar una función compartida entre muchas especies de Streptomyces, buscamos identificar características conservadas particulares de Streptomyces eCIS. Con este fin, buscamos genomas de Streptomyces disponibles públicamente e identificamos 153 regiones codificantes de eCIS dentro de 127 genomas de Streptomyces (Datos complementarios 3). Los eCIS se han clasificado previamente en 6 subtipos distintos según la similitud de secuencia y la disposición genética3. La mayoría (>80%) de las especies de Streptomyces, incluido Sco, codifican un eCIS tipo IId, como se señaló anteriormente3; por lo tanto, suponemos que cualquier función eCIS conservada debe ser realizada por este tipo.

La mayoría de las regiones eCIS codifican proteínas con dominios asociados con la actividad de la toxina. Se cree que estas proteínas se ensamblan en la partícula eCIS y se inyectan en las células diana para mediar en la destrucción celular10,42,43. No pudimos identificar una proteína codificada con frecuencia dentro de las regiones eCIS de Streptomyces que contenía un dominio de toxina identificable. Sin embargo, una búsqueda BLAST44 con la proteína Sco4256, que descubrimos que era un componente de la partícula Sco eCIS (Tabla complementaria 1), reveló proteínas estrechamente relacionadas codificadas en el 90% de los 105 eCIS de clase IId de Streptomyces (Datos complementarios 4). La alineación de un grupo representativo de secuencias y el análisis estructural utilizando HHpred45 sugirieron una arquitectura de tres dominios y se predijo que el segundo dominio sería una región helicoidal transmembrana (Fig. 6a; Datos complementarios 5). El primer dominio, presente en todos los homólogos, muestra similitudes de alta probabilidad con las chaperonas periplásmicas involucradas en el ensamblaje del pilus entre otras estructuras y familias (Datos complementarios 5). Aproximadamente un tercio de los homólogos, incluido el de Sco, poseen un tercer dominio C-terminal con similitud con varias toxinas bacterianas y lectinas hemolíticas (Fig. 6b; Datos complementarios 5). Estas proteínas pueden ser entregadas por eCIS como carga tóxica. Curiosamente, también se identificaron homólogos de estas proteínas en regiones eCIS de clase IId en genomas de otras especies de actinobacterias y varias especies de cianobacterias filamentosas y cloroflexos (Fig. 6a; Datos complementarios 4). Rara vez se encontraron proteínas con una similitud muy significativa con Sco4256 en regiones que no codifican eCIS.

a HHpred alineó y analizó una selección diversa de resultados de una búsqueda BLAST iniciada con Sco4256, la supuesta toxina. Las secuencias que se muestran son de especies de Streptomyces (sin sombrear), otras especies de Actinomycetes (sombreadas en gris), Cyanobacteria (sombreadas en verde) y Chorflexi (sombreadas en amarillo). Todas las proteínas están asociadas con sistemas de tipo IId y todos los géneros son filamentosos excepto Cyanothece. b Se muestra un esquema de los dominios conservados de proteínas relacionadas con Sco4256. c Se alineó una selección diversa de resultados de una búsqueda BLAST iniciada con Sco4242, la supuesta fibra. Las secuencias que se muestran son de especies de Streptomyces (sin sombrear), otras especies de Actinomycetes (sombreadas en gris). Estas proteínas se encuentran en el eCIS tipo IId. Todas las alineaciones se realizaron con MUSCLE62 tal como se implementó en Jalview63. Se utilizó el esquema de coloración clustal.

El eCIS5,13,20 estructuralmente caracterizado y las colas de fagos contráctiles1 tienen proteínas de fibra unidas a sus placas base. En los fagos, estas fibras median la unión de la célula huésped. En la mayoría de los genomas de fagos de cola contráctil y en los genomas de eCIS8,11,13,14 caracterizados, las proteínas de fibra se codifican inmediatamente aguas abajo de los genes que codifican las proteínas de cuña de la placa base, BW2 y BW3. En la región Sco eCIS, se descubrió que el producto proteico del gen en esta posición (sco4242) (Fig. 1b) era un componente de la partícula eCIS (Tabla complementaria 1). Una búsqueda BLAST con esta proteína reveló homólogos estrechamente relacionados en el 75% de las regiones eCIS de clase IId en Streptomyces y en el eCIS de clase IId de otras especies de Actinomycetes (Fig. 6c; Datos complementarios 6). La alineación de estas proteínas reveló una región C-terminal conservada de aproximadamente 150 residuos de largo, que está precedida por un motivo transmembrana fuertemente predicho (Fig. 6c). El dominio C-terminal tiene una gran similitud con los dominios de degradación de carbohidratos, como lo predice HHpred (Datos complementarios 7). Dado que las proteínas de unión al receptor de los fagos, de las cuales las fibras son un grupo, a menudo se unen o degradan los carbohidratos en la superficie de la célula bacteriana, estas funciones previstas de la proteína Sco4242 son consistentes con su función como proteína de unión a la superficie de la célula bacteriana. El dominio conservado 2, que comprende aproximadamente 50 residuos que preceden inmediatamente al segmento transmembrana, es rico en Cys y puede ser un dominio de unión a Zn como lo predice HHpred (Datos complementarios 7). Esta región podría mediar en la unión de estas proteínas a la placa base. En resumen, nuestros datos bioinformáticos (resumidos en Datos complementarios 1) muestran que la mayoría de los eCIS de Streptomyces tipo IId comparten supuestas proteínas de fibra y toxina relacionadas, lo que respalda una función común para eCIS en este género.

Las partículas eCIS son producidas por especies bacterianas en clados bacterianos muy divergentes. La aparición dispersa de eCIS y su papel demostrado en la mediación de actividades tóxicas contra células eucariotas ha llevado a considerar estos sistemas como mecanismos de defensa, útiles en condiciones específicas pero no centrales para la función celular normal. Los resultados presentados aquí introducen un papel completamente distinto para eCIS en Sco, donde parecen participar en el proceso de desarrollo de esta especie. En particular, hemos demostrado que Sco produce partículas de eCIS como parte de su ciclo de crecimiento normal y que las cepas que carecen de partículas de eCIS funcionales exhiben alteraciones pronunciadas en su programa de desarrollo. Estos cambios incluyeron la perturbación de la producción de antibióticos durante el crecimiento en medios sólidos y líquidos (Fig. 4a; Fig. 6 complementaria) y el desarrollo acelerado de hifas aéreas en medios sólidos (Fig. 4b, c). Lo más intrigante es que los mutantes deficientes en eCIS mostraron niveles significativamente reducidos de muerte celular y morfología alterada durante el crecimiento líquido (Fig. 3). Estos resultados sugieren que Sco eCIS funciona induciendo letalidad dentro de la cepa, lo que puede desempeñar un papel en el proceso de desarrollo.

A diferencia de un estudio anterior sobre Streptomyces lividans, no detectamos la inhibición del crecimiento de S. cerevisiae mediada por eCIS por Sco22. Dado que los eCIS de estas dos especies están muy relacionados, esperaríamos que realizaran la misma función. Es posible que no hayamos detectado la actividad inhibidora del crecimiento del Sco eCIS porque utilizamos un ensayo diferente que puede no ser tan sensible como el utilizado en el otro estudio. Además, dado que observamos cambios complicados en la producción de antibióticos por parte de las cepas deficientes en eCIS, es posible que los efectos indirectos en la producción de antibióticos causaran los efectos observados en el estudio anterior. Esta idea está respaldada por la ausencia de inhibición del crecimiento de S. cerevisiae inducida por la cepa M1152 (Fig. 2a), que no produce los cuatro principales antibióticos Sco. Casu et al.46 también descubrieron recientemente que el Sco eCIS no desempeñaba ningún papel en la inhibición del crecimiento de otras especies bacterianas o de S. cerevisiae.

Mientras que los lisados de Sco intracelulares mostraban en su mayoría estructuras eCIS completamente revestidas con una apariencia típica (Fig. 1c), las muestras extracelulares contenían casi exclusivamente especies de vaina contraídas vacías (Fig. 1e). Esta marcada diferencia entre los grupos intracelulares y extracelulares de estructuras derivadas de eCIS sugirió que los eCIS no escapaban de las células a través de una lisis generalizada, una conclusión también respaldada por la ausencia de ActR, una proteína citoplasmática, en las fracciones extracelulares que contienen proteínas de vaina (Figura complementaria .1b,d). Un modelo que podría explicar la observación anterior es que en los micelios intactos las estructuras en forma de cola están unidas a una membrana. Al encontrar el estímulo apropiado, el eCIS puede extenderse a través de la membrana para contactar una célula vecina, lo que provoca la contracción y liberación de la vaina contraída. Los Sco eCIS de 300 nm de longitud son considerablemente más largos que otros eCIS, que miden aproximadamente 120 nm5,14,20 y los fagos de cola contráctil que infectan bacterias Gram-positivas poseen colas de hasta 200 nm de longitud47. Por lo tanto, un Sco eCIS unido a una membrana es, en teoría, lo suficientemente largo como para extenderse a través de la membrana y la pared celular de su célula huésped y contactar con una célula cercana. La posibilidad de que Sco eCIS esté adherido a la membrana celular también está respaldada por la presencia conservada de una hélice transmembrana fuertemente predicha en su supuesta proteína de fibra (Fig. 6c). En un estudio reciente sobre Anaboena, una cianobacteria filamentosa, se demostró que las estructuras eCIS estaban ancladas a la membrana tilacoide mediante una hélice transmembrana en una proteína similar a una fibra que estaba unida a la placa base13. Aunque no observamos fibras en las partículas de Sco eCIS, detectamos la supuesta proteína de fibra en nuestras muestras purificadas mediante espectrometría de masas (Tabla complementaria 1). Las condiciones de lisis celular durante la purificación probablemente alterarían las interacciones de la membrana, dejando las fibras en conformaciones variables que podrían ser difíciles de distinguir mediante TEM.

Casu et al.46 sugirieron otro mecanismo de acción para el Sco eCIS. Utilizando tomografía crioelectrónica (cryoET), observaron eCIS extendidos flotantes exclusivamente dentro de hifas intactas. En las hifas parcialmente lisadas, vieron una mezcla de eCIS extendido y contraído, mientras que las células fantasma, que son células sin membrana que muestran solo una capa de peptidoglicano, contenían solo eCIS contraído. Llegaron a la conclusión de que la acción del eCIS que implica la contracción de la vaina provoca la lisis desde el interior de las células. Nuestros datos también son consistentes con este modelo con el supuesto de que ActR no escapa fácilmente de las células fantasma o que solo un pequeño porcentaje de células fueron lisadas durante el período de inducción de ActR en nuestros experimentos (45 min).

Una posible limitación de nuestro estudio es que algunos experimentos clave, como los que investigan la muerte celular, se realizaron en cultivos líquidos en los que Sco no esporula. Sin embargo, se ha demostrado que el programa de desarrollo con respecto a la expresión génica es similar en medio líquido y sólido48,49. Por lo tanto, esperamos ver diferencias relacionadas durante el crecimiento en medios sólidos donde también se ha demostrado que ocurre la muerte celular50,51,52.

La degradación vegetativa de las hifas durante el desarrollo se ha reconocido desde hace mucho tiempo como una característica del desarrollo de los estreptomicetos53 y, más recientemente, se ha postulado que la muerte celular programada ocurre como parte del cambio del crecimiento micelial vegetativo al aéreo25,50,54. Se cree que una etapa coordinada de muerte celular limitada a un subconjunto de la población de hifas vegetativas durante el desarrollo puede servir para proporcionar nutrientes adicionales al micelio aéreo reproductivo en crecimiento y las hifas muertas también pueden desempeñar un papel estructural o facilitar el transporte de nutrientes51,52,55 ,56. De acuerdo con un papel en esta etapa del ciclo de vida de Sco, hemos demostrado que la expresión de eCIS alcanza su punto máximo al final de la fase de crecimiento vegetativo en un patrón temporal similar al gen regulador del antibiótico, redD. El requisito de BldA, un regulador maestro del interruptor morfogenético, para la expresión de los genes Sco eCIS también respalda un papel en este proceso. El aparente requisito de bldA para la expresión de genes eCIS en muchas especies de Streptomyces, así como la conservación de supuestas proteínas efectoras y de fibra entre muchas regiones de Streptomyces eCIS, sugieren que estos eCIS pueden compartir una función conservada en la muerte celular programada. Esta función compartida en el ciclo de vida de Streptomyces explicaría la aparición muy frecuente de eCIS en este clado. Curiosamente, recientemente se propuso un papel en la muerte celular intracepa para el eCIS de Anabaena, que también tiene un estilo de vida complejo13. Descubrimos que el eCIS de diversos actinomicetos y otras cianobacterias filamentosas codifica homólogos de la supuesta proteína efectora Sco4256, lo que proporciona otra conexión entre la función del eCIS en estos dos grupos filamentosos de bacterias.

Para concluir, este estudio ha revelado una función de eCIS en la mediación de la letalidad celular intracepa que afecta el proceso de desarrollo de Streptomyces, lo que respalda que eCIS puede poseer actividad bactericida y participar en el ciclo de vida normal de una especie bacteriana.

Las cepas bacterianas, los plásmidos y los cósmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 3. Todas las cepas de Streptomyces utilizadas fueron derivados de Streptomyces coelicolor A3 (2). Las cepas Sco se cultivaron a 30 °C en medio de agar maltosa-extracto de levadura-extracto de malta (MYM) durante 3 días o en medio líquido de extracto de levadura-extracto de malta (YEME)58 con agitación continua durante 3 días, a menos que se indique lo contrario. Otras cepas bacterianas se cultivaron en medio Lysogeny Broth (LB) o agar (pH 7,0) a 37 °C a menos que se indique lo contrario. Saccharomyces cerevisiae se cultivaron en medio YPD o agar (pH 7,0) a 30 °C.

Las secuencias del promotor eCIS se amplificaron a partir de ADN genómico Sco M145 de tipo salvaje utilizando los cebadores SCO_eCISp1p2GEN y SCO_eCISp3p4GEN (Tabla complementaria 4). Los fragmentos de PCR resultantes se usaron como plantilla para introducir un sitio de corte romo EcoRV usando los cebadores SCO_eCISp1p2EcoRV y SCO_eCISp3p4EcoRV. Los productos de la PCR se clonaron en el sitio EcoRV del plásmido pFlux32 en la orientación directa e inversa para poder probar ambas direcciones transcripcionales de las regiones promotoras divergentes. Todos los plásmidos fueron verificados mediante secuenciación. Los plásmidos indicadores resultantes pFlux-eCISp1-p4 se electroporaron en células de E. coli ET12567/pUZ8002 deficientes en metilación58. Los plásmidos se introdujeron en Sco de tipo salvaje mediante conjugación intergénica y selección en apramicina (50 µg/ml)58.

Para los ensayos de luminiscencia, se resuspendieron 104 unidades formadoras de esporas (SFU) de cada cepa indicadora Sco en 10 µl de solución salina y se sembraron por triplicado en 200 µl de agar de soja-manitol (MS)59 en placas de poliestireno de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 7 días a 30 °C y la luminiscencia se midió tres veces al día utilizando un lector de placas multietiquetas PerkinElmer Victor X.

Para crear reemplazos genómicos de los genes que codifican la vaina de la cola, la placa base y la ATPasa de eCIS, se empleó el método REDIRECT para la orientación por PCR en Streptomyces como se describe58. El casete aac3(IV)-oriT, que confiere resistencia a la apramicina, se amplificó utilizando los pares de cebadores SCO4253_Disrp, SCO_BP_Disrp o SCO4259_Disrp, respectivamente (Tabla complementaria 4). Los casetes amplificados se usaron para reemplazar los respectivos genes eCIS en el cósmido StD8a60. Los cósmidos resultantes (enumerados en la Tabla complementaria 3) se introdujeron mediante conjugación de la cepa de E. coli no metilante ET12567/pUZ800258 en la cepa de tipo salvaje M145 para obtener exconjugantes resistentes a apramicina. Para seleccionar exconjugantes de doble entrecruzamiento, se analizaron las colonias resistentes a aparamicina para detectar resistencia a kanamicina. Se seleccionaron tres cepas exconjugantes de ApraR KanS para cada gen, como resultado de eventos de conjugación separados. Las cepas mutantes se confirmaron mediante PCR utilizando oligonucleótidos; StD8aΔTS_aac(3)IV, StD8aΔBP_aac(3)IV o StD8aΔATP_aac(3)IV (Tabla complementaria 4), respectivamente y mediante secuenciación de ADN.

Se inocularon Sco M145 o Sco Δsco4253 (ΔTS) de tipo salvaje por triplicado experimental en medio líquido R2YE a una concentración final de 1,5 × 106 SFU/ml. Los cultivos se cultivaron con agitación durante 22 horas a 30 °C. Todos los cultivos se estandarizaron a una DO450 de 0,5. Las células se recuperaron mediante centrifugación a 3500 x g durante 10 minutos, se resuspendieron en solución salina y se centrifugaron nuevamente a 3500 x g durante 10 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 ml de medio mínimo RG2 nuevo. Los cultivos se incubaron a 30 °C con agitación continua durante 94 h. Para la comparación visual de la producción de pigmento, se tomaron imágenes de los cultivos en crecimiento usando una cámara NIKON D3000 en una posición fija dentro de una caja de luz en tiempos de 0, 18 h, 24 h, 41 h, 49 h, 65 h, 70 h y 94 h. Para la cuantificación de la producción total de actinorrodina, se recogieron muestras de 480 µl en los momentos indicados anteriormente. Se agregaron 120 µl de KOH 5 M hasta una concentración final de 1 M, y las muestras se agitaron y se centrifugaron a 3000 x g durante 5 minutos. La absorbancia del sobrenadante a 640 nm se leyó utilizando una placa de poliestireno de 96 pocillos. Cada ensayo se estandarizó según el peso del sedimento.

Se sembraron 108 SFU de cepas mutantes Sco de tipo salvaje o deficientes en eCIS en duplicado biológico en placas de agar R2YE y se cultivaron a 30 °C. A partir de las 24 horas posteriores a la germinación, se aplicaron suavemente cubreobjetos de vidrio esterilizados a la superficie superior de cada césped bacteriano a intervalos de aproximadamente 12 horas. Los cubreobjetos se sellaron sobre un portaobjetos de vidrio para microscopio y se examinaron utilizando un microscopio de luz transmitida por Zeiss con un aumento de 40X. Posteriormente, las imágenes se analizaron utilizando Adobe Photoshop CS6 v.13.0. El fondo se normalizó a una diapositiva WT vacía y se calculó la densidad total de píxeles para cada imagen. Se realizó una prueba t de dos muestras asumiendo una varianza igual para comparar la densidad de hifas media de cada mutante eCIS con la media de la muestra WT.

Se detectaron esporas (105 SFU suspendidas en 5 µl de solución salina al 0,85%) de Sco M145, M1152 de tipo salvaje o las cepas mutantes eCIS ΔTS o M1152 ΔTS en placas de agar R2YE. Las placas se incubaron durante 3 días a 30 °C antes de cubrirlas con 5 ml de agar LB extrablando fundido (agar al 0,5%) que contenía los organismos que se iban a analizar (con una DO600 final que oscilaba entre 0,01 y 0,1). Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche y se evaluó la actividad antimicrobiana midiendo las zonas de aclaramiento en el césped indicador. El área de superficie de las zonas de eliminación inducida por las cepas Sco M145 se cuantificó utilizando ImageJ v. 1.53. Los ensayos contra cepas de Streptomyces se realizaron superponiendo una placa de colonia de 3 días con 1 ml de solución salina al 0,85 % que contenía 5 µl de esporas concentradas de Streptomyces. Las placas se incubaron durante 3 días a 30 °C antes de evaluar la actividad antimicrobiana. Los ensayos contra Saccharomyces cerevisiae se realizaron superponiendo una placa de colonia de 4 días con 5 ml de agar YPD extrablando fundido que contenía S. cerevisiae (con una DO600 final que oscila entre 0,05 y 0,2). Las placas se incubaron a 30 °C durante la noche.

Las proteínas TS y BW1 se expresaron y purificaron a partir de E. coli. Los genes que codifican la proteína BW1 (sco4245) y la proteína TS (sco4253) se clonaron a partir del ADN genómico de Sco en el sitio BseR1 del vector p15TV-L utilizando el kit de clonación In-fusion HD (Clonetech) utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 4. Verificado Los plásmidos se transformaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, se cultivaron a 37 °C con antibióticos apropiados hasta una DO600 de 0,6 y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 1 mM. Los cultivos se cultivaron durante 16 a 18 horas a 17 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón de unión (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 5 mM, β-mercaptoetanol (βME) 5 mM). Las células se lisaron mediante sonicación. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 25.000 xg durante 20 minutos a 4 °C. Las proteínas se purificaron por afinidad mediante incubación con 2 ml de resina de agarosa Ni-NTA (Invitrogen) durante 30 minutos a 4 °C. La mezcla se pasó a través de una columna a temperatura ambiente y se lavó extensamente con tampón de unión que contenía imidazol 30 mM. Las proteínas unidas se eluyeron con tampón de unión que contenía imidazol 300 mM y se dializaron durante la noche a 4 °C en tampón que contenía; Tris·HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glicerol al 5% (vol/vol), DTT 1 mM. Las muestras se concentraron utilizando concentradores de filtro Vivaspin (Sigma-Aldrich) y se separaron adicionalmente utilizando una columna de exclusión de tamaño Superdex200 16/60 en un sistema de cromatografía líquida de rendimiento rápido ÄKTA (GE Healthcare). Las fracciones relevantes se analizaron y verificaron mediante SDS-PAGE y se concentraron hasta una concentración final de 0,1 – 0,25 mg/ml.

El laboratorio Gray-Owen de la Universidad de Toronto generó generosamente anticuerpos policlonales de ratón. Se mezcló proteína purificada fresca a una concentración de 0,05 a 0,25 mg/ml con 100 µl de adyuvante Emulsigen y se inyectó en ratones. Se administró una segunda dosis de refuerzo 21 días después. Los antisueros se recogieron el día 35. La especificidad de los antisueros se probó mediante análisis de transferencia Western con controles apropiados. Los datos de origen y la validación se proporcionan dentro del archivo de datos de origen.

Las cepas Sco se cultivaron en agar MYM a 30 °C durante 4 días. Se cortaron de la placa cuadrados de 1 cm2 de agar que contenía micelio y esporas y se transfirieron directamente a 50 ml de medio líquido YEME. Las células se incubaron a 30 °C durante los distintos tiempos indicados con agitación. Se sedimentaron las células y se tomó una muestra extracelular (E) del sobrenadante. Los pellets se lavaron en sacarosa al 10% y se centrifugaron nuevamente, se resuspendieron en 16 ml de tampón P61 suplementado con 2 mg/ml de lisozima y se incubaron a 30 °C durante 1 hora. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón C (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 15 % vol/vol, DTT 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, una tableta por 50 ml de tampón)), y sonicado. Las células lisadas se centrifugaron a 12.000 x g durante 20 minutos y luego el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 µm. Las muestras filtradas se centrifugaron a 150.000 × g durante 3 h a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 5 ml de 1XPBS enfriado con hielo. Las muestras se cargaron en columnas que contenían 5 ml de resina de intercambio aniónico DEAE Sepharose (Sigma-Aldrich), se lavaron extensamente con PBS y eluyeron usando NaCl 0,5 M en tampón PBS. Las muestras se ultracentrifugaron a 150.000 x g durante 90 minutos a 4 ° C y los sedimentos se resuspendieron en 200 μl de PBS enfriado con hielo y se almacenaron a 4 ° C durante hasta dos semanas.

Las muestras se mezclaron en una proporción de 1:1 con tampón de carga 2 X SDS (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8; SDS 4 %; glicerol 20 %; β-mercaptoetanol (βME) 200 mM; azul de bromofenol 0,2 %. Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida SDS Tris-Tricina al 12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó durante 1 hora en leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween al 1% (TBS-T). Cuando se probó con anticuerpos específicos de α-eCIS, se añadió antisuero en una dilución de 1:5000 en TBS-T con leche al 5 %. Alternativamente, se añadió anticuerpo primario α-FLAG (Sigma-Aldrich, F7425) en una dilución de 1:10.000. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después del lavado, las membranas se sondaron con antirratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (IgG-HRP sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) o anti-conejo de ratón (IgG HRP sc-2357, Santa Cruz Biotechnology) en una dilución 1:2000 en TBS. -T durante 1 hora a temperatura ambiente y revelado utilizando reactivos quimioluminiscentes (GE Healthcare).

Las muestras de eCIS purificadas se centrifugaron brevemente para eliminar las impurezas y se aplicaron 5 μl de sobrenadante sobre rejillas de cobre recubiertas de carbón recién descargadas por luminiscencia (CF400-CU, 6 nm, malla 400, Electron Microscopy Sciences). Se dejó que las muestras se adsorbieran durante 2 minutos antes de secarlas con papel de filtro y las rejillas se lavaron dos veces con agua destilada filtrada. Las rejillas se tiñeron negativamente con 15 μL de acetato de uranilo al 2% durante 15 segundos. Se tomaron imágenes de las cuadrículas con una cámara CDD digital JEM-1011 (JEOL USA, INC.) (XR50S de 5 megapíxeles, AMT, EE. UU.).

Se inocularon cepas Sco de tipo salvaje o mutantes eCIS en 40 ml de medio de cultivo YEME a partir de esporas frescas a una densidad de 107/ml y se incubaron a 30 °C con agitación. Se centrifugaron muestras de 1 ml durante 5 minutos a 8000 x g, se lavaron dos veces y se resuspendieron en 1 ml de agua destilada. Se utilizó el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD Bac-Light (L7012; Invitrogen) para teñir las células. La suspensión bacteriana se mezcló con 3 µl de SYTO 9 y colorantes de ácido nucleico de yoduro de propidio (PI), premezclados en una proporción de 1:1. La suspensión celular y las tinciones de ácido nucleico se mezclaron con un vórtex y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. Se depositaron 10 µl de la suspensión en un portaobjetos limpio y se cubrieron con un cubreobjetos cuadrado de 18 mm. Las imágenes se adquirieron dentro de los 30 minutos posteriores a la incubación utilizando un generador de imágenes Zeiss Axio 2, con una excitación de 488 nm y 568 nm y una emisión de 530 nm (verde) o 630 nm (rojo). Las imágenes se analizaron con Zeiss Zen Blue, versión 3.0.19154.1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH) y el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9 versión 9.5.0.

Las muestras de eCIS se purificaron como se describe anteriormente. Las muestras extracelulares se purificaron de manera similar a partir de sobrenadantes libres de células después del paso de centrifugación inicial a 7000 × g. Se redujeron muestras purificadas de 30 a 150 µg de proteína total con DTT, se alquilaron con yodoacetamida y se sometieron a digestión tríptica. Los espectros de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida se recogieron en un instrumento de trampa de iones lineal (Thermo Fisher) (SPARC BioCentre, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá). Las proteínas se identificaron utilizando Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido) y se analizaron en Scaffold versión 5.2.2 (Proteome Software Inc., Portland, OR, EE. UU.). El límite para la identificación de proteínas se fijó en un nivel de confianza del 95%.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de espectrometría de masas para muestras Sco eCIS purificadas generadas en este estudio se depositaron en la base de datos MassIVE con el código de acceso; MSV000091288 [https://doi.org/10.25345/C5CC0V388]. Todos los datos restantes están disponibles en la Información complementaria, los Datos complementarios 1-7 y el archivo de datos fuente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Los autores desean agradecer a Robert Flick del Centro BioZone de Biociencia Aplicada y Bioingeniería de la Universidad de Toronto y a la Dra. Leanne Wybenga-Groot del SPARC BioCentre, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá, por su ayuda con el análisis de datos de espectrometría de masas. Los autores desean agradecer a Avi Odenheimer por su ayuda con el procesamiento de imágenes y las ilustraciones. MV recibió el apoyo de una beca de doctorado internacional de Connaught. Este trabajo fue apoyado por Discovery Grants para ARD (RGPIN-201) y JRN (RGPIN-2021-03861) del Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Naturales (Canadá).

Departamento de Bioquímica, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario, Canadá

María Vladimirov, Stefanie Mak, Justin R. Nodwell y Alan R. Davidson

Departamento de Genética Molecular, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario, Canadá

Ruo Xi Zhang y Alan R. Davidson

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MV concibió y realizó la mayoría de los experimentos presentados. RXZ realizó algunas de las purificaciones de partículas de eCIS y ensayos de destrucción entre especies. SM ayudó en la realización de experimentos con S. coelicolor. JRN proporcionó supervisión, asesoramiento y edición del manuscrito. ARD supervisó el proyecto. MV y ARD escribieron el artículo.

Correspondencia a Alan R. Davidson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Vladimirov, M., Zhang, RX, Mak, S. et al. Se requiere un sistema de inyección contráctil para la muerte celular regulada por el desarrollo en Streptomyces coelicolor. Nat Comuna 14, 1469 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37087-7

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Recibido: 19 de enero de 2023

Aceptado: 28 de febrero de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37087-7

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